scVelo — RNA-Geschwindigkeitsanalyse

Was macht scVelo — RNA-Geschwindigkeitsanalyse?

Überblick

scVelo ist das führende Python-Paket für die RNA-Geschwindigkeitsanalyse in Einzelzell-RNA-seq-Daten. Es leitet Zellzustandsübergänge ab, indem es die Kinetik des mRNA-Spleißens modelliert – indem es das Verhältnis von ungespleißter (prä-mRNA) zu gespleißter (reifer mRNA) Häufigkeit verwendet, um zu bestimmen, ob ein Gen in jeder Zelle hoch- oder herunterreguliert wird. Dies ermöglicht die Rekonstruktion von Entwicklungstrajektorien und die Identifizierung von Zellschicksalentscheidungen, ohne dass Zeitreihendaten erforderlich sind.

Installation: uv pip install scvelo

Wichtige Ressourcen:

• Dokumentation: https://scvelo.readthedocs.io/
• GitHub: https://github.com/theislab/scvelo
• Paper: Bergen et al. (2020) Nature Biotechnology. PMID: 32747759

Wann man diese Fähigkeit einsetzen sollte

Verwenden Sie scVelo, wenn:

• Trajektorieninferenz aus Schnappschussdaten: Bestimmen Sie, in welche Richtung sich Zellen differenzieren
• Vorhersage des Zellschicksals: Identifizieren Sie Vorläuferzellen und ihre nachgeschalteten Schicksale
• Identifizierung von Treibergenen: Finden Sie Gene, deren Dynamik die beobachteten Trajektorien am besten erklärt
• Entwicklungsbiologie: Modellieren Sie Hämatopoese, Neurogenese, epithelial-mesenchymale Übergänge
• Schätzung der latenten Zeit: Ordnen Sie Zellen entlang einer aus der Spleißdynamik abgeleiteten Pseudozeit an
• Ergänzung zu Scanpy: Fügen Sie UMAP-Einbettungen Richtungsinformationen hinzu

Voraussetzungen

scVelo erfordert Zählmatrizen für sowohl ungespleißte als auch gespleißte RNA. Diese werden generiert durch:

1. STARsolo oder kallisto|bustools mit dem Modus lamanno
2. velocyto CLI: velocyto run10x / velocyto run
3. alevin-fry / simpleaf mit gespleißtem/ungespleißtem Output

Die Daten werden in einem AnnData-Objekt mit layers["spliced"] und layers["unspliced"] gespeichert.

Standard RNA-Geschwindigkeits-Workflow

1. Einrichtung und Datenladen

import scvelo as scv
import scanpy as sc
import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt

# Einstellungen konfigurieren
scv.settings.verbosity = 3       # Berechnungsschritte anzeigen
scv.settings.presenter_view = True
scv.settings.set_figure_params('scvelo')

# Daten laden (AnnData mit gespleißten/ungespleißten Schichten)
# Option A: Aus loom laden (velocyto-Output)
adata = scv.read("cellranger_output.loom", cache=True)

# Option B: Velocyto-loom mit Scanpy-verarbeitetem AnnData zusammenführen
adata_processed = sc.read_h5ad("processed.h5ad")  # Hat UMAP, Cluster
adata_velocity = scv.read("velocyto.loom")
adata = scv.utils.merge(adata_processed, adata_velocity)

# Schichten überprüfen
print(adata)
# obs × var: N × G
# layers: 'spliced', 'unspliced' (erforderlich)
# obsm['X_umap'] (erforderlich für die Visualisierung)

2. Vorverarbeitung

# Filtern und normalisieren. Seit scVelo 0.3 filtert filter_and_normalize() nur
# Gene und normalisiert pro Zelle – es nimmt kein n_top_genes mehr und
# log-transformiert nicht mehr, daher kommen der log-Schritt und die HVG-Auswahl von Scanpy.
scv.pp.filter_and_normalize(
    adata,
    min_shared_counts=20    # Mindestanzahl an Counts in gespleißt+ungespleißt
)
sc.pp.log1p(adata)
sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=2000, subset=True)

# Momente erster und zweiter Ordnung berechnen (Mittelwerte und Varianzen)
# knn_connectivities müssen zuerst berechnet werden
sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=30, n_pcs=30)
scv.pp.moments(
    adata,
    n_pcs=30,
    n_neighbors=30
)

3. Geschwindigkeitsschätzung — Stochastisches Modell

Das stochastische Modell ist schnell und geeignet für explorative Analysen:

# Stochastische Geschwindigkeit (schneller, weniger genau)
scv.tl.velocity(adata, mode='stochastic')
scv.tl.velocity_graph(adata)

# Visualisieren
scv.pl.velocity_embedding_stream(
    adata,
    basis='umap',
    color='leiden',
    title="RNA-Geschwindigkeit (Stochastisch)"
)

4. Geschwindigkeitsschätzung — Dynamisches Modell (Empfohlen)

Das dynamische Modell passt die vollständige Spleißkinetik an und ist genauer:

# Dynamik wiederherstellen (rechenintensiv; ~10-30 Min. für 10K Zellen)
scv.tl.recover_dynamics(adata, n_jobs=4)

# Geschwindigkeit aus dem dynamischen Modell berechnen
scv.tl.velocity(adata, mode='dynamical')
scv.tl.velocity_graph(adata)

5. Latente Zeit

Das dynamische Modell ermöglicht die Berechnung einer gemeinsamen latenten Zeit (Pseudozeit):

# Latente Zeit berechnen
scv.tl.latent_time(adata)

# Latente Zeit auf UMAP visualisieren
scv.pl.scatter(
    adata,
    color='latent_time',
    color_map='gnuplot',
    size=80,
    title='Latente Zeit'
)

# Top-Gene identifizieren, geordnet nach latenter Zeit
top_genes = adata.var['fit_likelihood'].sort_values(ascending=False).index[:300]
scv.pl.heatmap(
    adata,
    var_names=top_genes,
    sortby='latent_time',
    col_color='leiden',
    n_convolve=100
)

6. Treibergen-Analyse

# Gene mit der höchsten Geschwindigkeitsanpassung identifizieren
scv.tl.rank_velocity_genes(adata, groupby='leiden', min_corr=0.3)
df = scv.DataFrame(adata.uns['rank_velocity_genes']['names'])
print(df.head(10))

# Geschwindigkeit und Kohärenz
scv.tl.velocity_confidence(adata)
scv.pl.scatter(
    adata,
    c=['velocity_length', 'velocity_confidence'],
    cmap='coolwarm',
    perc=[5, 95]
)

# Phasenporträts für bestimmte Gene
scv.pl.velocity(adata, ['Cpe', 'Gnao1', 'Ins2'],
               ncols=3, figsize=(16, 4))

7. Geschwindigkeitspfeile und Pseudozeit

# Pfeilplot auf UMAP
scv.pl.velocity_embedding(
    adata,
    arrow_length=3,
    arrow_size=2,
    color='leiden',
    basis='umap'
)

# Stromlinienplot (sauberere Visualisierung)
scv.pl.velocity_embedding_stream(
    adata,
    basis='umap',
    color='leiden',
    smooth=0.8,
    min_mass=4
)

# Geschwindigkeits-Pseudozeit (Alternative zur latenten Zeit)
scv.tl.velocity_pseudotime(adata)
scv.pl.scatter(adata, color='velocity_pseudotime', cmap='gnuplot')

8. PAGA-Trajektoriengraph

# PAGA-Graph mit geschwindigkeitsinformierten Übergängen
scv.tl.paga(adata, groups='leiden')
df = scv.get_df(adata, 'paga/transitions_confidence', precision=2).T
df.style.background_gradient(cmap='Blues').format('{:.2g}')

# PAGA mit Geschwindigkeit plotten
scv.pl.paga(
    adata,
    basis='umap',
    size=50,
    alpha=0.1,
    min_edge_width=2,
    node_size_scale=1.5
)

Vollständiges Workflow-Skript

import scvelo as scv
import scanpy as sc

def run_rna_velocity(adata, n_top_genes=2000, mode='dynamical', n_jobs=4):
    """
    Vollständiger RNA-Geschwindigkeits-Workflow.

    Args:
        adata: AnnData mit 'spliced'- und 'unspliced'-Schichten, UMAP in obsm
        n_top_genes: Anzahl der Top-HVGs für die Geschwindigkeit
        mode: 'stochastic' (schnell) oder 'dynamical' (genau)
        n_jobs: Parallele Jobs für das dynamische Modell

    Returns:
        Verarbeitetes AnnData mit Geschwindigkeitsinformationen
    """
    scv.settings.verbosity = 2

    # 1. Vorverarbeitung (scVelo 0.3 hat log/HVG aus filter_and_normalize entfernt)
    scv.pp.filter_and_normalize(adata, min_shared_counts=20)
    sc.pp.log1p(adata)
    sc.pp.highly_variable_genes(adata, n_top_genes=n_top_genes, subset=True)

    if 'neighbors' not in adata.uns:
        sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=30)

    scv.pp.moments(adata, n_pcs=30, n_neighbors=30)

    # 2. Geschwindigkeitsschätzung
    if mode == 'dynamical':
        scv.tl.recover_dynamics(adata, n_jobs=n_jobs)

    scv.tl.velocity(adata, mode=mode)
    scv.tl.velocity_graph(adata)

    # 3. Nachgelagerte Analysen
    if mode == 'dynamical':
        scv.tl.latent_time(adata)
        scv.tl.rank_velocity_genes(adata, groupby='leiden', min_corr=0.3)

    scv.tl.velocity_confidence(adata)
    scv.tl.velocity_pseudotime(adata)

    return adata

Wichtige Ausgabefelder in AnnData

Nach Ausführung des Workflows werden die folgenden Felder hinzugefügt:

Ort	Schlüssel	Beschreibung
adata.layers	velocity	RNA-Geschwindigkeit pro Gen pro Zelle
adata.layers	fit_t	Angepasste latente Zeit pro Gen pro Zelle
adata.obsm	velocity_umap	2D-Geschwindigkeitsvektoren auf UMAP
adata.obs	velocity_pseudotime	Pseudozeit aus der Geschwindigkeit
adata.obs	latent_time	Latente Zeit aus dem dynamischen Modell
adata.obs	velocity_length	Geschwindigkeit jeder Zelle
adata.obs	velocity_confidence	Konfidenzwert pro Zelle
adata.var	fit_likelihood	Güte der Modellanpassung auf Genebene
adata.var	fit_alpha	Transkriptionsrate
adata.var	fit_beta	Spleißrate
adata.var	fit_gamma	Abbaurate
adata.uns	velocity_graph	Zell-Zell-Übergangswahrscheinlichkeitsmatrix

Vergleich der Geschwindigkeitsmodelle

Modell	Geschwindigkeit	Genauigkeit	Wann verwenden
stochastic	Schnell	Mittel	Explorative Analyse; große Datensätze
deterministic	Mittel	Mittel	Einfache lineare Kinetik
dynamical	Langsam	Hoch	Publikationsqualität; identifiziert Treibergene

Best Practices

• Beginnen Sie mit dem stochastischen Modus zur Exploration; wechseln Sie für die finale Analyse zum dynamischen Modell
• Benötigen gute Abdeckung der ungespleißten Reads: Kurze Reads (< 100 bp) können die Intronabdeckung verpassen
• Mindestens 2.000 Zellen: RNA-Geschwindigkeit ist bei weniger Zellen verrauscht
• Die Geschwindigkeit sollte kohärent sein: Pfeile sollten der bekannten Biologie folgen; Zufälligkeit weist auf Probleme hin
• k-NN-Bandbreite ist wichtig: Zu wenige Nachbarn → verrauschte Geschwindigkeit; zu viele → überglättet
• Plausibilitätsprüfung: Wurzelzellen (Vorläufer) sollten hohe ungespleißte/gespleißte Verhältnisse für Markergene aufweisen
• Das dynamische Modell erfordert verschiedene kinetische Zustände: Funktioniert am besten für klare Differenzierungsprozesse

Fehlerbehebung

Problem	Lösung
Fehlende ungespleißte Schicht	Führen Sie velocyto erneut aus oder verwenden Sie STARsolo mit --soloFeatures Gene Velocyto
Sehr wenige Geschwindigkeitsgene	Verringern Sie min_shared_counts; überprüfen Sie die Sequenziertiefe
Zufällig aussehende Pfeile	Versuchen Sie andere n_neighbors oder ein anderes Geschwindigkeitsmodell
Speicherfehler bei dynamischem Modell	Setzen Sie n_jobs=1; reduzieren Sie n_top_genes
Negative Geschwindigkeit überall	Überprüfen Sie, ob die gespleißten/ungespleißten Schichten nicht vertauscht sind

Zusätzliche Ressourcen

• scVelo-Dokumentation: https://scvelo.readthedocs.io/
• Tutorial-Notebooks: https://scvelo.readthedocs.io/tutorials/
• GitHub: https://github.com/theislab/scvelo
• Paper: Bergen V et al. (2020) Nature Biotechnology. PMID: 32747759
• velocyto (Vorverarbeitung): http://velocyto.org/
• CellRank (Schicksalsvorhersage, erweitert scVelo): https://cellrank.readthedocs.io/
• dynamo (Alternative zur metabolischen Markierung): https://dynamo-release.readthedocs.io/