分析方法驗證 是做什麼的？
使用時機
每當需要確認某分析程序是否適合其預期用途時：設計驗證研究、評估驗證數據、確認藥典程序、將程序轉移至另一實驗室或儀器，或在報告中為上述任何一項進行辯護。
兩條規則
1. 在設計任何內容之前，先確定主導的規範架構。 同一分析方法在 ICH Q2(R2)、USP <1225>、ICH M10、CLSI EP 和 ISO/IEC 17025 下有不同的驗證方式。它們在所需的特性、研究的組織方式，以及是否提供數值允收標準方面存在差異。將它們混合使用會產生一個無法滿足任何規範的計畫書。
2. 在收集數據之前陳述允收標準。 在見到結果後選擇的標準並非允收標準，且事後決定標準是常見的稽核缺失。ICH Q2(R2) 刻意不提供幾乎任何數值標準——它們必須來自規格、分析目標概況（ICH Q14 第 3 節）或開發數據。ICH M10 是個例外：它提供了明確的數值，且這些數值在層析分析法與配體結合法之間有所不同。
範圍
此技能負責規劃研究、正確計算統計數據並組織文件。它不負責判定某程序已通過驗證、放行批次、接受或拒絕運作、結束調查，或替代分析師、技術審查員、品質單位或監管機構。每個指令碼都會報告；但沒有一個會做出結論。
版權邊界
ICH 指南公開發布並允許在標明出處的情況下重複使用，因此其要求直接編碼在此技能中。USP 通則、CLSI EP 文件和 ISO 標準受版權保護且需付費使用。 對於這些規範，此技能提供其名稱、範圍以及如何取得授權副本——絕不提供原文，也絕不發明閾值。請勿要求代理程式檢索、轉錄或重建其內容。如果某個數值很重要且位於付費文件中，請從授權副本中讀取。
規範架構
cd skills/analytical-method-validation/scripts
python3 plan_validation.py --list-frameworks
| 鍵值 | 管轄範圍 | 是否提供數值標準 |
|---|---|---|
ich-q2r2 | 原料藥與產品的放行與穩定性測試 | 幾乎不提供 — 由你自行推導 |
ich-m10 | 生物分析濃度測量（PK、TK、BE） | 是，且因檢測模式而異 |
usp-1220 | 藥典程序生命週期，三個階段 | 需付費 |
usp-1225 / usp-1226 | 藥典程序的驗證/確認 | 需付費 |
clsi | 臨床實驗室測量程序（EP 系列） | 需付費 |
iso-17025 | 認證下的實驗室自建與修改方法 | 無 — 「在必要範圍內」 |
Q2(R2) 於 2023 年 11 月取代 Q2(R1) 並重組了特性。 範圍現為上層特性（第 3.2 節），包含回應（線性）和下範圍限制的驗證（偵測極限/定量極限）。準確度與精密度為第 3.3 節，可根據單一標準進行組合評估。穩健性被視為開發活動，並交叉引用 ICH Q14。多變量程序得到明確處理（2.5 和 3.2.2.3），附錄 2 新增了 Q2(R1) 從未涵蓋的技術實例——定量 ¹H-NMR、NIR、定量 LC/MS、qPCR、生物分析與粒徑。一份以 Q2(R1) 為形狀的計畫書——一個包含線性、範圍、準確度、精密度、專一性、偵測極限、定量極限、穩健性的平面列表——已經過時。另請注意 2023 年 11 月 30 日對表 5 和表 6–11 的錯誤更正。
指令碼
cd skills/analytical-method-validation/scripts
| 指令碼 | 解決的問題 |
|---|---|
plan_validation.py | 哪個架構、哪些特性、什麼研究佈局、什麼計畫書？ |
check_response.py | 校準模型是否真實在整個範圍內成立？ |
check_accuracy_precision.py | 回收率是多少？變異性中有多少來自日間差異？ |
check_detection_limits.py | 每種允許方法下的偵測極限和定量極限是多少，它們是否滿足報告閾值？ |
check_bioanalytical_run.py | 此次運作是否符合其檢測模式的 ICH M10 要求？ |
compare_methods.py | 兩個程序是否在預先聲明的範圍內等效？ |
所有指令碼都接受 --format table|tsv|json。來源、指南引用和注意事項輸出至 stderr；數據輸出至 stdout，因此 > out.tsv 可將它們分開。退出碼為 0（無發現）、1（有發現）、2（輸入錯誤）——因此任何一個都可用於串接工作流程。
工作流程
1. 確認架構與所需特性
python3 plan_validation.py --framework ich-q2r2 --attribute assay --technique hplc --range-use assay
Q2(R2) 表 1 根據測量屬性而非技術來決定所需內容。對於含量分析：專一性、回應、準確度、重複性、中間精密度。對於限度測試：僅需專一性和偵測極限。對於鑑別測試：僅需專一性。接受的屬性包括 assay、impurity（定量）、impurity-limit 和 identity。
可報告範圍來自規格。Q2(R2) 表 2 提供了實例——含量分析為宣稱含量的 80–120%，含量均一性為 70–130%，雜質為報告閾值到規格的 120%。
2. 產生計畫書並填入標準
python3 plan_validation.py --framework ich-q2r2 --attribute impurity --protocol > protocol.md
每個括號內的欄位都是在數據收集之前需要決定並記錄的決策。計畫書骨架刻意拒絕為 Q2(R2) 工作預先填入允收標準，因為沒有可辯護的默認值。
3. 評估回應
python3 check_response.py -i calibration.csv --max-back-calc-error 2
輸入格式為 level,response，每行一次進樣；同一水平的多行視為重複，提供它們是使線性檢定成為可能的關鍵。
來自一條決定係數會讓其輕鬆通過的曲線的真實輸出：
statistic value
distinct levels 5
slope 166.6000
intercept 2495.0000
intercept CI includes 0 no
coefficient of determination (r2) 0.9830
lack-of-fit F 469.5294
lack-of-fit p 1.5139e-06
runs test p 0.0492
level n mean_response mean_back_calculated relative_error_pct
50.0000 2 10075.0000 45.4982 -9.0036
75.0000 2 15150.0000 75.9604 1.2805
100.0000 2 20050.0000 105.3721 5.3721
125.0000 2 24050.0000 129.3818 3.5054
150.0000 2 26450.0000 143.7875 -4.1417
r² = 0.983 但該模型不可用：範圍底部的回算誤差為 −9.0%，失擬 p 值 = 1.5 × 10⁻⁶，殘差符號非隨機。r² 不是線性的證據——它隨範圍增加而上升，且對曲率幾乎不敏感。針對純誤差的失擬 F 檢定和殘差模式才是證據，這就是為什麼 Q2(R2) 3.2.2.1 要求分析點偏離線的情況，而不是僅提供相關係數。
為寬範圍曲線添加 --weight 1/x2。當範圍上三分之一部分的殘差變異數超過下三分之一部分 10 倍以上時，該指令碼會標記異質變異性，因為未加權的擬合會正好在報告閾值所在的低端產生偏誤。
4. 評估準確度與精密度
python3 check_accuracy_precision.py -i ap.csv --accuracy-limit 2 --rsd-limit 1.0 --design-check assay
輸入格式為 level,measured,group，其中 group 是中間精密度的因子——例如天、分析師或儀器。
level component sd rsd_pct df ci90_low_sd ci90_high_sd
100 repeatability (within group) 0.0707 0.0707 3 0.0438 0.2065
100 between-group 1.6515 1.6515 2 n/a n/a
100 intermediate precision (total) 1.6530 1.6530 2.0037 0.9554 7.2821
0.07% RSD 的重複性看起來極佳；中間精密度為 1.65%，大了二十三倍，因為變異性完全來自日間差異。將當日數據報告為該程序的精密度，會使常規性能低估一個數量級以上。這就是為什麼該指令碼擬合單因子隨機效應模型而非合併。
該指令碼為您處理了兩個陷阱：
- 精密度是在每個水平內估計，絕不跨水平合併。 將 80/100/120% 的結果合併為一個標準差，會將範圍本身變成明顯的不精密度。該指令碼報告每個水平的結果，並以標稱值的百分比提供一個與水平無關的視圖。
--require-ci-within-limit強制要求整個信賴區間位於限值內，而不僅僅是平均值。Q2(R2) 3.3.1.4 要求區間與標準相容；一個在六次重複中勉強落在限值內的平均值，並未證明太多。
5. 建立偵測極限與定量極限，並進行確認
python3 check_detection_limits.py --calibration lowcal.csv --blanks blanks.csv \
--confirm-ql 0.05 --confirm-data ql_check.csv --reporting-threshold 0.05
approach sigma slope DL QL
sd-and-slope (sigma = residual SD of regression) 7.2816 5033.3490 0.0048 0.0145
sd-and-slope (sigma = SD of y-intercept) 4.3303 5033.3490 0.0028 0.0086
sd-and-slope (sigma = SD of 8 blanks) 3.7702 5033.3490 0.0025 0.0075
相同的數據產生的 QL 估計值跨度達 1.9 倍，純粹來自於 σ 的選擇。因此 Q2(R2) 3.2.3.5 要求報告極限值以及用於確定該極限值的方法，並使用接近或等於估計極限值的樣品進行確認。對於雜質程序，QL 必須等於或低於報告閾值。反射性地使用 3.3σ/slope、報告一個沒有命名方法的數字、且從不進行確認，是三個獨立的不符合事項。
6. 依據 ICH M10 的生物分析運作
python3 check_bioanalytical_run.py --modality chromatographic --run run1.csv
python3 check_bioanalytical_run.py --modality lba --isr isr.csv
python3 check_bioanalytical_run.py --modality lba --criteria
--modality 是強制性的，沒有默認值，因為標準確實不同：
| 層析法 | 配體結合法 | |
|---|---|---|
| 校準容忍度 | ±15%，LLOQ 為 ±20% | ±20%，LLOQ 和 ULOQ 為 ±25% |
| 準確度 / 精密度 | ±15% / ≤15% CV（LLOQ 為 ±20% / ≤20% CV） | ±20% / ≤20% CV（LLOQ 和 ULOQ 為 ±25% / ≤25% CV） |
| A&P 設計 | 4 個 QC 水平，每個運作 5 個重複，≥3 個運作，≥2 天 | 5 個 QC 水平，每個運作 3 個重複，≥6 個運作，≥2 天 |
| 總誤差 | 無此標準 | ≤30%，LLOQ 和 ULOQ 為 ≤40% |
| ISR 一致性 | ≥2/3 重複的差異在 ±20% 內 | ≥2/3 重複的差異在 ±30% 內 |
將 ±15% 的層析法標準應用於配體結合法，或將 LBA 的總誤差標準導入層析法，都是常見且錯誤的。
該運作檢查會強制執行一個經常被忽略的每個水平規則：至少 2/3 的所有 QC 且每個水平至少 50%。一個運作可能通過總體比例，但某個單一水平卻完全失敗。
finding: QC level high: 0/2 within tolerance (0%); M10 requires at least 50% at each level
7. 轉移與方法比較
python3 compare_methods.py -i paired.csv --margin 2 --relative --slope-tolerance 0.05
mean difference (%) 1.4646
TOST margin 2.0000
TOST p-value 1.0528e-13
90% CI (TOST) 1.44127 to 1.48797
equivalent at stated margin yes
--- for contrast only ---
paired t-test p (NOT equivalence) 0.0000
OLS slope (biased here) 1.0396
Deming slope 1.0398
Passing-Bablok slope 1.0351
此指令碼取代了兩個錯誤：
- 「p > 0.05，無顯著差異，因此這些方法等效。」 未能偵測出差異並非等效的證據，且在一個小的轉移數據集上，這個結果幾乎是必然的。TOST 檢定的是真正重要的假設——真實差異位於預先聲明的範圍內。在此，t 檢定顯示差異高度顯著且 TOST 顯示方法在 ±2% 範圍內等效；兩者都為真，但只有一個回答了問題。
- 用於方法比較的最小平方迴歸。 OLS 假定參考值沒有誤差，這在比較兩個程序時是錯誤的，會使斜率偏離零。戴明迴歸（需指定誤差變異數比）和 Passing–Bablok 迴歸（非參數、抗離群值）是適當的迴歸方法，此處與 OLS 並列報告以供對比。
該指令碼還會標記比例偏差——當差異隨濃度變化時，單一的平均偏差及其一致界限無論看起來多緊密，都具有誤導性。
此技能存在的目的
- 在 Q2(R2) 取代 Q2(R1) 三年後，仍根據 ICH Q2(R1) 的結構進行驗證。
- 在看到數據後才制定允收標準。
- 將 r² 呈現為線性的證據。
- 將重複性報告為程序的精密度，而日間成分卻不可見。
- 提供一個沒有命名方法的 DQL 數字且未經確認。
- 將層析法 M10 標準應用於配體結合法，或反過來。
- 在方法轉移中，將 t 檢定的非顯著性呈現為等效性。
參考資料
references/framework-selection.md— 哪個架構管轄，以及根據什麼問題references/ich-q2r2-summary.md— Q2(R2) 結構變更（相對於 Q2(R1)）references/ich-m10-summary.md— M10 標準摘要
支援
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