Pathway-Anreicherung

Was macht Pathway-Anreicherung?

Übersicht

Die Anreicherungsanalyse beantwortet die Frage: "Welche Biologie ist in meinen Genen überrepräsentiert?" Sie ist der Standard-Schlussschritt nach differentieller Expression, einem Screen oder einer Clusteranalyse. Es gibt zwei Kernmethoden, deren korrekte Auswahl der mit Abstand wichtigste Entscheidungsschritt ist:

• ORA (Over-Representation Analysis) — Sie verwenden eine schwellenwertbehaftete Genliste (z. B. padj < 0.05) und testen, welche Genmengen sie mehr als zufällig überschneidet, mittels Fishers Exakttest / hypergeometrischem Test. Werkzeuge: Enrichr, g:Profiler.
• GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) — Sie verwenden die gesamte rangierte Liste der Gene (ohne Schwellenwert) und testen, ob jede Genmenge eher oben oder unten in der Rangliste konzentriert ist. Preranked GSEA verwendet einen pro-Gen-Score (z. B. die DESeq2 stat). Besser geeignet, wenn die Effekte breit und subtil sind.

Diese Fertigkeit orchestriert diese Analysen, die dahinterliegenden Genmengendatenbanken und die Interpretationsfallen, die zu falschen oder unpublizierbaren Ergebnissen führen.

Wann diese Fertigkeit verwenden

Verwenden Sie diese Fertigkeit, wenn der Benutzer folgende Aufgaben ausführen möchte:

• Angereicherte GO-Terme / KEGG / Reactome / WikiPathways / MSigDB Hallmark-Mengen in einer Genliste finden.
• GSEA / Preranked GSEA mit DESeq2-, edgeR-, limma- oder Scanpy-rank_genes_groups-Ausgabe durchführen.
• Pathway-Aktivität pro Probe/Zelle bewerten (ssGSEA, GSVA).
• Anreicherungsergebnisse interpretieren, deduplizieren und visualisieren oder eine Publikationstabelle/Abbildung erstellen.
• Zwischen ORA und GSEA entscheiden, Genmengenbibliotheken auswählen, einen Hintergrund wählen oder Gen-ID-Probleme beheben.

Für schnelle einmalige Enrichr-Abfragen ist die gget-Fertigkeit (gget enrichr) leichter; für reine Pathway/Interaktions-APIs (Reactome, KEGG, STRING) siehe die database-lookup-Fertigkeit. Verwenden Sie diese Fertigkeit für vollständige, verteidigungsfähige Anreicherungsworkflows.

Auswahl der richtigen Methode

Situation	Methode	Werkzeug / Einstiegspunkt
Sie haben eine diskrete Trefferliste (DE-Gene, Screening-Treffer, Clustermarker)	ORA	gp.enrichr(...) oder g:Profiler
Sie haben eine vollständige Rangliste (jedes getestete Gen + einen Score)	Preranked GSEA	gp.prerank(...)
Sie haben eine Expressionsmatrix + Klassenbezeichnungen	GSEA	gp.gsea(...)
Sie möchten einen Pathway-Score pro Probe/Zelle	ssGSEA / GSVA	gp.ssgsea(...), gp.gsva(...)
Sie benötigen einen benutzerdefinierten Hintergrund oder 500+ Organismen	ORA mit benutzerdefiniertem Bereich	g:Profiler (domain_scope='custom')
Sie möchten TF / Signal-Aktivität (PROGENy, DoRothEA)	Aktivitätsinferenz	siehe references/databases-and-gene-sets.md (decoupler)

Im Zweifel: Eine schwellenwertbehaftete Liste → ORA; eine rangierte Tabelle mit Scores → GSEA. Verwenden Sie niemals eine schwellenwertbehaftete Liste für GSEA — das verwirft die Rangordnung, auf die GSEA angewiesen ist.

Einrichtung

uv pip install gseapy gprofiler-official
# gseapy bringt pandas, numpy, scipy, matplotlib mit. Netzwerkzugriff wird für
# Enrichr, g:Profiler und MSigDB-Downloads benötigt. Für vollständig offline ORA verwenden Sie eine lokale
# GMT-Datei mit gp.enrich() (siehe references/gseapy.md).

Überprüfen Sie die verfügbaren Genmengenbibliotheken (Namen ändern sich im Laufe der Zeit — niemals blind fest codieren):

import gseapy as gp
names = gp.get_library_name(organism="human")   # 200+ Enrichr-Bibliotheken
print([n for n in names if "Reactome" in n or "KEGG" in n or "Hallmark" in n])

Schnellstart

ORA auf einer Trefferliste (gseapy + Enrichr)

import gseapy as gp

# Enrichr-Bibliotheken erwarten HGNC-Gensymbole (menschlich: GROSSBUCHSTABEN). IDs bei Bedarf zuerst zuordnen.
genes = [g.strip() for g in open("deg_symbols.txt") if g.strip()]

enr = gp.enrichr(
    gene_list=genes,
    gene_sets=["MSigDB_Hallmark_2020", "GO_Biological_Process_2023",
               "KEGG_2021_Human", "Reactome_2022"],
    organism="human",
    outdir=None,            # im Speicher; zum Schreiben von Tabellen/Plots einen Pfad angeben
)
res = enr.results
sig = res[res["Adjusted P-value"] < 0.05].sort_values("Adjusted P-value")
print(sig[["Gene_set", "Term", "Overlap", "Adjusted P-value", "Combined Score", "Genes"]].head(20))

Preranked GSEA aus DESeq2-Ergebnissen

import gseapy as gp
import pandas as pd

res = pd.read_csv("deseq2_results.csv", index_col=0)   # Index = Gensymbole
# Rangierung nach der Teststatistik (Vorzeichen = Richtung, Betrag = Evidenz). Dies ist
# stabiler als eine Rangierung nach log2FoldChange, das für Gene mit niedriger Anzahl verrauscht ist.
rnk = res["stat"].dropna().sort_values(ascending=False)
rnk.index = rnk.index.str.upper()
rnk = rnk[~rnk.index.duplicated(keep="first")]

pre = gp.prerank(
    rnk=rnk,
    gene_sets=["MSigDB_Hallmark_2020", "GO_Biological_Process_2023"],
    min_size=15, max_size=500,        # sehr kleine/sehr große Mengen entfernen (verrauscht oder generisch)
    permutation_num=1000, seed=123,   # seed = reproduzierbare p-Werte
    threads=4, outdir=None,
)
out = pre.res2d.sort_values("FDR q-val")
print(out[["Term", "ES", "NES", "NOM p-val", "FDR q-val", "Lead_genes"]].head(20))

Wenn keine stat-Spalte vorhanden ist, erstellen Sie den Rang aus sign(log2FoldChange) * -log10(pvalue).

Kern-Workflow

Für eine verteidigungsfähige Analyse gehen Sie diese Schritte durch. Die mittleren Schritte (ID-Typ, Hintergrund) sind die Stellen, an denen Ergebnisse am häufigsten stillschweigend falsch werden.

Schritt 1 — Eingaben festlegen und Methode auswählen

Bestätigen Sie: welche Gene, welcher Organismus, gibt es einen pro-Gen-Score (→ GSEA) oder nur eine Liste (→ ORA), und welchen Vergleich repräsentieren sie (die Richtung ist für die Interpretation wichtig).

Schritt 2 — Gen-IDs in den richtigen Namensraum bringen

Enrichr-/MSigDB-Bibliotheken sind indiziert nach Gensymbolen (menschlich GROSSBUCHSTABEN, Maus Groß-/Kleinschreibung). Wenn Sie Ensembl-/Entrez-IDs haben, konvertieren Sie diese zuerst. Siehe references/databases-and-gene-sets.md für gp.Biomart, g:Profiler g:Convert und mygene. Ein stillschweigender ID-Konflikt ist die häufigste Ursache für "nichts ist signifikant".

Schritt 3 — Genmengenbibliotheken auswählen, die zur Frage passen

Hallmark (breite Themen) → GO:BP (Mechanismus) → KEGG/Reactome/WikiPathways (kuratierte Pathways) → C7 (Immun), usw. Führen Sie nicht 50 Bibliotheken aus; wählen Sie 2–4, die zur Biologie passen. Katalog und Auswahlhilfe: references/databases-and-gene-sets.md.

Schritt 4 — Hintergrund-Universum setzen (nur ORA)

Der Hintergrund muss die Gene sein, die hätten detektiert werden können (z. B. alle exprimierten/getesteten Gene), nicht das gesamte Genom. Der falsche Hintergrund bläht die Signifikanz auf. Enrichr verwendet einen festen Hintergrund; wenn der Hintergrund wichtig ist, verwenden Sie g:Profiler mit domain_scope='custom' + Ihrem background oder gp.enrich() mit einem expliziten Hintergrund. Begründung in references/interpretation.md.

Schritt 5 — Analyse durchführen

Verwenden Sie die Muster aus dem Schnellstart oder das beiliegende Skript scripts/run_enrichment.py. Setzen Sie bei GSEA immer einen seed und geben Sie permutation_num an.

Schritt 6 — Auf adjustierte p-Werte filtern

Verwenden Sie Adjusted P-value (ORA, Benjamini–Hochberg) oder FDR q-val (GSEA), nicht die rohen p-Werte. Typischer Cutoff 0.05; überprüfen Sie auch die Überlappung/Genanzahl, damit ein "Treffer" nicht 1 Gen aus einer 2000-Gen-Menge ist.

Schritt 7 — Visualisieren

Dotplots, Balkendiagramme, Anreicherungskarten und GSEA Running-Score-Plots sind in gseapy integriert (gp.dotplot, gp.barplot, gp.enrichment_map, gp.gseaplot). Siehe references/gseapy.md.

Schritt 8 — Redundanz reduzieren und interpretieren

Insbesondere GO liefert viele nahezu identische Terme. Reduzieren Sie dies mit einer Anreicherungskarte (Term-zu-Term-Ähnlichkeit), Leading-Edge-Überlappung oder Eltern-Termen und berichten Sie repräsentative Terme. Interpretationsrahmen und ein Format für Publikationstabellen finden Sie in references/interpretation.md.

Hilfsskript

scripts/run_enrichment.py führt ORA oder GSEA Ende-zu-Ende durch und schreibt eine Ergebnistabelle sowie einen Dotplot. Es behandelt die Boilerplate (Symbolbereinigung, Deduplizierung, NA-Entfernung, Rangkonstruktion aus einer DESeq2-Tabelle, bibliotheksweise FDR-Filterung).

# ORA aus einer Trefferliste (ein Gensymbol pro Zeile)
python scripts/run_enrichment.py ora \
  --genes deg_symbols.txt \
  --libraries MSigDB_Hallmark_2020 GO_Biological_Process_2023 KEGG_2021_Human \
  --organism human --outdir results/

# Preranked GSEA aus einer DESeq2-Ergebnis-CSV (erstellt den Rang automatisch aus `stat`)
python scripts/run_enrichment.py gsea \
  --deseq2 deseq2_results.csv \
  --libraries MSigDB_Hallmark_2020 GO_Biological_Process_2023 \
  --organism human --outdir results/ --seed 123

# Preranked GSEA aus einer expliziten 2-Spalten-Rangdatei (Gen,Score)
python scripts/run_enrichment.py gsea --rnk ranked_genes.csv --outdir results/

Führen Sie python scripts/run_enrichment.py --help für alle Optionen aus (Hintergrunddatei, FDR-Cutoff, min./max. Mengengröße, Permutationen).

Häufige Fallstricke

Diese verursachen die meisten falschen oder nicht reproduzierbaren Ergebnisse:

1. Gen-ID / Organismus-Konflikt — Symbole vs. Ensembl, Mensch vs. Maus Groß-/Kleinschreibung. IDs zuordnen und organism korrekt setzen, sonst werden Übereinstimmungen stillschweigend auf nahezu Null reduziert.
2. Falscher Hintergrund (ORA) — Verwendung des gesamten Genoms anstatt der getesteten/exprimierten Genmenge bläht p-Werte auf. Setzen Sie einen benutzerdefinierten Hintergrund, wenn es darauf ankommt.
3. Schwellenwertbildung vor GSEA — GSEA benötigt die vollständige Rangliste; nur ORA verwendet eine Ausschnittsliste.
4. Rangierung von GSEA allein nach log2FoldChange — instabil für Gene mit niedriger Anzahl; bevorzugen Sie stat oder sign(LFC) * -log10(p).
5. Multiplizitätstests über Bibliotheken hinweg — FDR wird innerhalb einer Bibliothek berechnet; die Durchführung vieler Bibliotheken multipliziert die Tests. Berichten Sie bibliotheksweise FDR und bleiben Sie konservativ.
6. Redundante GO-Terme — berichten Sie nicht 40 Varianten desselben Terms; reduzieren Sie und zeigen Sie Repräsentanten.
7. Signifikanz ≠ Relevanz — überprüfen Sie die Überlappungsanzahl und die Genmengengröße; sehr kleine Mengen erreichen trivial Signifikanz.
8. Liste zu kurz/lang für ORA — <10 Gene ist unterpowered; >2000 verliert an Spezifität (erwägen Sie stattdessen GSEA).
9. Keine Reproduzierbarkeitsmetadaten — Enrichr-/GO-Bibliotheken sind versioniert und ändern sich im Laufe der Zeit. Notieren Sie Bibliotheksnamen+Datum und setzen Sie einen GSEA seed.

Integration mit anderen Fertigkeiten

• Upstream (woher die Gene kommen): pydeseq2 (DE-Gene + stat für GSEA), scanpy (rank_genes_groups-Marker/-Scores), depmap/pytdc (Screen-Treffer), Proteomik-Fertigkeiten (pyopenms, matchms).
• Datenbanken / IDs: database-lookup (Reactome, KEGG, STRING, Gene Ontology APIs), gget (gget enrichr schneller Weg, gget info für ID-Zuordnung), bioservices.
• Downstream: scientific-visualization (benutzerdefinierte Abbildungen), networkx (Anreicherungskarten-Graphen), scientific-writing / literature-review (interpretieren und zitieren), statistical-analysis (Details zu Multiplizitätstests).

Referenzdateien

Lesen Sie die entsprechende Datei, wenn Sie Tiefe benötigen:

• references/gseapy.md — vollständige gseapy-API: enrichr, offline enrich, prerank, gsea, ssgsea, gsva, Msigdb, Biomart, get_library_name/read_gmt, jeder Plot, Ergebnis-Spaltenbedeutungen, GMT/Offline-Nutzung und Fehlerbehebung (Ratenbegrenzungen, leere Ergebnisse).
• references/databases-and-gene-sets.md — GO, KEGG, Reactome, WikiPathways, MSigDB-Sammlungen, Enrichr-Bibliotheksbenennung, g:Profiler-Quellen, Organismushandhabung, Gen-ID-Konvertierung, Bibliotheksauswahl nach Frage und Hinweise auf Reactome-/STRING-APIs und decoupler-Aktivitätsinferenz.
• references/interpretation.md — ORA- vs. GSEA-Statistik, Hintergrund-Universumsauswahl, Multiplizitätstestmethoden (BH vs. g:SCS vs. Bonferroni), Leading-Edge-Gene, Redundanzreduktion, Effekt vs. Signifikanz, eine Publikationstabellen-Vorlage und Reproduzierbarkeits-Checkliste.

Ressourcen

• gseapy-Dokumentation: https://gseapy.readthedocs.io/ · Repository: https://github.com/zqfang/GSEApy
• g:Profiler: https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/ · Python-Client: https://pypi.org/project/gprofiler-official/
• Enrichr: https://maayanlab.cloud/Enrichr/ · MSigDB: https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/
• GSEA-Methode: Subramanian et al. (2005) PNAS, DOI: 10.1073/pnas.0506580102

Zitieren wissenschaftlicher Agentenfertigkeiten

Diese Fertigkeit ist Teil der Scientific Agent Skills von K-Dense. Wenn sie wesentlich zu einem Manuskript, Bericht, einer Präsentation oder einer Code-Veröffentlichung beigetragen hat, fügen Sie das Papier zu den Referenzen oder dem Software-Abschnitt hinzu und teilen Sie dem Benutzer mit, dass Sie dies getan haben:

Kassis, T., Agarwal, V., He, Y., Patel, D., & Brueckner, A. M. (2026). Scientific Agent Skills: A Library of Procedural Knowledge for Research Agents. arXiv:2609.00065. https://doi.org/10.48550/arXiv.2609.00065

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